《醫學免疫學實驗》包括46 個實驗，涵蓋基礎免疫學實驗、臨床免疫學實驗及設計性實驗三部分內容。基礎免疫學實驗是《醫學免疫學實驗》重點介紹的內容，按照實驗動物、
免疫細胞和免疫分子實驗的邏輯順序編寫。實驗動物部分既包括了傳統的實驗動物基本操作、免疫相關動物模型的建立，同時也增加了常用的轉基
因、基因突變或基因敲除小鼠特點的介紹。免疫細胞實驗部分包括免疫細胞分離、分選及功能檢測，同時將流式細胞術的分析、分選技術融入相關
實驗內容。免疫分子實驗部分包括了經典的抗體、補體和細胞因子的檢測方法，并介紹了Real-time PCR、流式細胞術等免疫新技術。臨床免疫學實
驗部分結合臨床檢驗，使用膠體金斑點層析技術、化學發光技術等檢測臨床早期妊娠、腫瘤標志物等。設計性實驗注重對學生綜合能力的培養，使
其掌握獨立設計綜合性實驗的能力。《醫學免疫學實驗》注重將基礎實驗與臨床實驗結合、新理論與新技術結合、驗證性實驗與綜合設計性實驗結合，內容豐富。
目 錄
前言
第一章 實驗動物基本操作 1
實驗一 實驗動物的抓取與固定方法 1
實驗二 實驗動物的給藥方法 4
實驗三 實驗動物的采血方法 7
第二章 免疫相關疾病動物模型建立 11
實驗一 小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立 11
實驗二 大鼠佐劑性關節炎模型的建立 14
實驗三 家兔 Masugi腎炎模型的建立 16
實驗四 小鼠過敏性哮喘模型的建立 19
第三章 免疫學常用小鼠品系 21
一、免疫學常用的野生型近交系小鼠 21
二、免疫學常用的轉基因、基因突變或基因敲除小鼠 22 目 錄
前言
第一章 實驗動物基本操作 1
實驗一 實驗動物的抓取與固定方法 1
實驗二 實驗動物的給藥方法 4
實驗三 實驗動物的采血方法 7
第二章 免疫相關疾病動物模型建立 11
實驗一 小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立 11
實驗二 大鼠佐劑性關節炎模型的建立 14
實驗三 家兔 Masugi腎炎模型的建立 16
實驗四 小鼠過敏性哮喘模型的建立 19
第三章 免疫學常用小鼠品系 21
一、免疫學常用的野生型近交系小鼠 21
二、免疫學常用的轉基因、基因突變或基因敲除小鼠 22
第四章 細胞培養基本操作 33
一、體內、體外細胞的差異和分化 33
二、體外培養細胞的分型 33
三、培養細胞的生長和增殖過程 34
實驗一 細胞培養器材的準備與無菌操作 36
實驗二 原代細胞培養 41
實驗三 細胞傳代培養 44
實驗四 細胞凍存與復蘇 46
實驗五 細胞計數與活力測定 48
第五章 免疫細胞的分離與制備 52
實驗一 人外周血單個核細胞的分離 52
實驗二 小鼠腹腔巨噬細胞的分離 55
實驗三 人外周血 NK細胞的分離 57
實驗四 小鼠骨髓樹突狀細胞的制備 61
實驗五 小鼠 CD4+T淋巴細胞的分離 64
實驗六 小鼠脾 B細胞的分離 66
第六章 免疫細胞功能檢測 69
實驗一 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗 69
實驗二 51Cr釋放法檢測 NK細胞殺傷活性的測定 71
實驗三 細胞毒性 T細胞功能測定 73
實驗四 樹突狀細胞對 CD4+T細胞的活化和增殖作用檢測 75
實驗五 樹突狀細胞誘導 CD4+T細胞分化作用檢測 78
實驗六 調節性 T細胞免疫抑制功能實驗 81
實驗七免疫細胞凋亡檢測 84
實驗八免疫印跡法檢測免疫細胞信號蛋白 ERK活化 92
第七章 抗體的人工制備 98
實驗一 多克隆抗體的制備 98
實驗二 單克隆抗體的制備 100
第八章 經典抗原抗體反應 104 實驗一 直接凝集反應 104
實驗二 間接凝集試驗 108
實驗三 單向瓊脂擴散實驗 110
實驗四 雙向瓊脂擴散實驗 112
實驗五 溶血空斑實驗 114
第九章 細胞因子檢測 117
實驗一 ELISA雙抗夾心法檢測細胞因子 117
實驗二 ELISOPT檢測細胞因子 119
實驗三 FACS檢測細胞因子 121
實驗四 Real-time PCR檢測細胞因子 123
實驗五 小鼠干擾素誘導的抗病毒活性的檢測 130
實驗六 趨化實驗檢測趨化因子的趨化功能 132
第十章 臨床免疫學實驗 135
實驗一 豚鼠速發型超敏反應 135
實驗二 血清總 IgE水平測定 136
實驗三 結核菌素試驗 138
實驗四 化學發光免疫分析技術檢測腫瘤標志物 140
實驗五 酶聯免疫吸附試驗檢測乙肝五項指標 141
實驗六 免疫熒光技術檢測抗核抗體 143
實驗七 膠體金斑點層析技術檢測早期妊娠 145
第十一章 設計性實驗 147
一、設計性實驗的選題、設計與實施 147
二、參考范例 151
主要參考文獻 154
實驗動物基本操作
實驗動物是生命科學研究的基礎和條件，而動物實驗是現代生命科學研究的一個重要手段。免疫學實驗中，常根據實驗目的和要求的不同選用不同的動物。免疫學常見的實驗動物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和綿羊等。本章介紹動物實驗的幾種基本操作，包括實驗動物的抓取、固定、給藥、采血等，這些基本操作是免疫學實驗中經常用到的，掌握的熟練程度將直接影響實驗能否順利進行。
實驗一 實驗動物的抓取與固定方法
實驗動物的抓取與固定是動物實驗操作技術中昀基本又很重要的一項基本技能。在進行實驗時，為了不損傷動物的健康，不影響觀察指標，并防止被動物咬傷，抓取動物前，要限制動物的活動，使動物處于安靜狀態。工作人員必須對各種動物的一般習性有所了解，掌握合理的抓取和固定方法。具體方法根據實驗內容和動物種類而定。操作時要小心仔細、大膽敏捷、熟練準確、不能粗暴，不能恐嚇動物，同時要愛惜動物，使動物少受痛苦。
【實驗目的】
掌握小鼠與大鼠的抓取和固定，熟悉豚鼠的抓取和固定，了解家兔的抓取與固定。
【實驗方法】
1. 小鼠的抓取和固定
（1）從鼠籠盒內將小鼠尾部捉住并提起，放在籠蓋（或表面粗糙的物體）上，輕輕向后牽拉鼠尾（圖 1-1A）。
（2）在小鼠向前掙脫時，用左手（熟練者也可用同一只手）拇指和示指抓住兩耳和頸部皮膚（圖 1-1B），環指、小指和手掌心夾住背部皮膚和尾部，并調整好動物在手中的姿勢（圖 1-1C）。右手即可進行各種操作，如皮下、肌肉和腹腔注射、灌胃，以及其他實驗操作。
圖 1-1小鼠的抓取
（3）如進行解剖手術和心臟采血等操作，均可使動物先取背臥式（必要時先進行麻醉），再用大頭針或線繩將鼠前后肢依次固定在木板上。
（4）尾靜脈取血或尾靜脈注射時，可用小鼠尾靜脈注射架固定（圖 1-2）；或倒放入適當大小和重量的容器，把小鼠放在里面只露尾巴，這種容器能夠壓住尾部不讓其活動，同時可起到驅趕血液的作用。
圖 1-2小鼠尾靜脈注射架
2. 大鼠的抓取與固定
大鼠的門齒很長，在抓取方法不當而受到驚嚇或激怒時易將操作者手指咬傷，所以不要采取突然襲擊式的抓取方法，實驗者應戴上防護手套（有經驗者也可不戴），右手輕輕抓住大鼠的尾巴向后拉，但要避免抓其尖端，以防尾巴尖端皮膚脫落。左手抓緊大鼠兩耳和頭頸部的皮膚，并將大鼠固定在左手中，右手則可進行操作（圖 1-3）。根據實驗需要也可進行板式固定或盒式固定，固定方法同小鼠，但固定器材較小鼠大些。
圖 1-3大鼠的抓取
3. 豚鼠的抓取與固定
豚鼠膽小易驚，抓取時必須穩、準、迅速。先用手掌扣住鼠背，抓住其肩胛上方，將手張開，用手環握住頸部，另一只手托住其臀部，即可輕輕提起、固定（圖 1-4）。其固定方法基本同大鼠。
圖 1-4豚鼠的抓取
4. 家兔的抓取和固定
從籠中抓取家兔時，先輕輕打開籠門，勿使其受驚，隨之將手伸入籠內，從頭前阻攔，兔便匍匐不動。此時用右手把兩耳輕壓于手心內，抓住頸部的被毛和皮，即可提起兔，然后用左手托住其臀部（圖 1-5A）或者托住其腹部（圖 1-5B），兔身的重量大部分落入左手上。切忌用手抓家兔的兩耳，實驗工作中家兔耳部常被用來進行采血、靜脈注射等，所以家兔的兩耳應盡量保持不受損傷。需要進行手術時，可將家兔固定在兔實驗臺上，固定四肢，門齒用細繩拴住。另外還有盒式固定法，可進行耳緣靜脈注射或采血等操作。
圖 1-5家兔的抓取
【注意事項】
1. 動物處于驚嚇中勿進行任何操作，可等待片刻，待其安靜。
2. 抓取動物切勿猶豫，應該膽大心細，速度要快。
3. 抓取小鼠要注意抓緊其頸部皮膚，使其頭部不能轉動，可預防被其咬傷，但切記不可太久，以免引起窒息死亡。
【思考題】
小鼠抓取過程中如何預防被其咬傷？
實驗二 實驗動物的給藥方法
在動物實驗中，為了觀察藥物引起的機體功能、代謝及形態等變化，常需要將藥物注入動物體內。給藥的途徑和方法多種多樣，可根據不同的實驗目的、實驗動物和藥物劑型、劑量等進行確定。
【實驗目的】
掌握小鼠的腹腔注射、灌胃和尾靜脈注射給藥方法；熟悉小鼠的其他給藥方法；了解家兔的給藥方法。
【實驗方法】
1. 皮下注射給藥
皮下注射給藥是將藥液推入動物皮下結締組織，經毛細血管、淋巴管吸收進入血液循環的過程。
操作時，常規消毒注射部位皮膚，然后用左手拇指和示指輕輕提起皮膚，右手持注射器，針頭取一鈍角角度刺入皮下，然后將針頭輕輕向左右擺動，如針頭易擺動則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無回血，可緩慢將藥物注入皮下。拔針時，左手拇指、示指捏住進針部位片刻，以防止藥物外漏。小鼠注射部位常選腹部兩側或背部的皮膚（圖 1-6A），豚鼠取腹部和大腿內側，家兔取背部大腿內側或耳根部。小鼠注射量為 0.2～0.5ml，家兔和豚鼠注射量為 0.5～1.0ml。
2. 皮內注射給藥
皮內注射給藥是將藥液注入皮膚的表皮和真皮之間，觀察皮膚血管的通透性變化或皮內反應。接種、過敏實驗等一般做皮內注射。
將注射部位的被毛剪掉，局部常規消毒，左手拇指和示指按住皮膚使之繃緊，在兩指之間，用結核菌素注射器連接 4.5號針頭穿刺，針頭進入皮膚淺層，再向上挑起并稍刺入，將藥液注入皮內。注射后皮膚出現一白色小皮丘，注射后 5s再拔出針頭，否則藥液會從針孔流出。雄性動物皮膚緊密，皮內注射時較雌性動物難度大。做皮內注射常選項背的皮膚（圖 1-6B），注射量為每次 0.1～0.2ml。
3. 肌內注射給藥
肌內注射給藥應選擇肌肉發達、無大血管通過的部位。
針頭直接刺入肌肉，回抽針栓如無回血即可注射。小鼠體積小，肌肉少，很少采用肌內注射。當給小鼠注射不溶于水而混懸于油或其他溶劑中的藥物時，采用肌內注射，注射部位多選大腿部肌肉（圖 1-6C），注射量每腿不超過 0.1ml。家兔、豚鼠多選臀部、大腿內側或外側，注射量不超過 2.0ml。
圖 1-6小鼠的皮內、皮下和肌內注射給藥
4. 灌胃給藥
固定動物，使其頭、頸和身體呈一直線。灌胃針頭從嘴角進入，壓住舌頭，抵住上顎，輕輕向內推進，進入食管后會有一個落空感，進入后就可以推注藥液了。如遇阻力，應退出后重插，不能強力插，以免穿破食管或誤入氣管。每只小鼠的灌胃昀大容積不超過 0.8ml（圖 1-7A）。
5. 腹腔注射給藥
用左手捕捉固定動物，使其腹部向上，鼠頭略低于尾部，右手將注射針頭自下腹部靠近腹白線的稍左側或右側刺入皮下，使針頭向前推 0.5～1.0cm，再以 45°角穿過腹肌刺向腹腔，此時有落空感，回抽無腸液、尿液和血液后緩慢注入藥液。注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉針頭，防止漏液。小鼠腹腔注射的給藥量為
0.5～1.0ml（圖 1-7B）。家兔等較大動物注射應先固定，于腹部中線旁側 1cm注射，注射量為 5.0ml。
6. 尾靜脈注射給藥
（1）小鼠：固定小鼠后，采用 75%酒精棉球擦拭的方法或者溫水浸泡的方法使小鼠的血管充盈。若小鼠的血管很不清楚，推薦采用溫水浸泡的方法，水溫以不燙手為宜。溫水浸泡 2～3min后，取出小鼠尾巴，用干棉球擦拭，待血管充盈，用酒精棉球擦拭后就可以進針了。若血管還未充盈，可反復用溫水浸泡。選擇血管，小鼠尾部有 2條動脈和 3條靜脈， 2條動脈分別在尾部的背側面和腹側面， 3條靜脈呈“品”字形分布，一般認為左右的 2條靜脈比較容易注射。一般要求進針部位靠近小鼠的尾端，這樣若注射失敗，還可再向上選擇進針點。但是進針部位不能太靠下，因越往下靜脈越細，操作越困難，一般以小鼠尾巴下 1/3的位置為宜。進針時操作者左手示指和拇指固定住小鼠的尾巴，讓小鼠的尾巴在經過拇指后向下彎曲，進針點靠近拇指指甲。針頭和血管呈約 30°角，針尖斜面朝上，輕輕挑刺入皮膚后針頭立即和血管平行，可將針頭刺入血管多半（圖 1-7C）。正常情況下，推注的過程應無明顯阻力，血管也不鼓起。推注藥液時動作宜輕柔，若發現血管鼓起，則表明針頭未刺入血管，需立即拔出針頭。拔出針頭后，用拇指按注射部位 1～2min，防止出血。
圖 1-7小鼠的灌胃、腹腔和尾靜脈注射給藥
（2）家兔：將手伸入兔籠內，于兔頭前阻攔其跑動，當其匍匐不動時，右手抓住頸部皮膚，將兔提起，左手隨之托住其臀部。將家兔按于桌上，一手輕輕按其頸部，一手輕挾耳根，使耳向前。剪去耳緣被毛，用酒精棉球輕輕按摩耳翼，壓迫耳根部靜脈，使耳緣靜脈擴張（圖 1-8A）。用左手拇指與中指、示指抓住耳尖部，右手從耳尖部邊緣平行進針（圖 1-8B），試推少量注射液，如果感覺無阻力，局部也無隆起、血管變色，表示已進入靜脈，可將注射液緩緩注入。若注射有誤，則注射時阻
圖 1-8家兔耳緣靜脈注射給藥
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