醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)
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叢 書 名:普通高等教育“十三五”規(guī)劃教材
本書主要介紹了抗原抗體反應(yīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)、免疫細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)、細(xì)胞因子及其他免疫分子檢測(cè)技術(shù)、抗體的制備技術(shù)。此外,為了培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?還單獨(dú)編寫了綜合性和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)這一章。全書所涉及的實(shí)驗(yàn)既能滿足多數(shù)高等醫(yī)學(xué)院校基本實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需要,又能很好地反映日益發(fā)展、不斷涌現(xiàn)的免疫學(xué)新技術(shù)、新方法。本書可供臨床、預(yù)防、基礎(chǔ)、口腔、麻醉、影像、藥學(xué)、檢驗(yàn)、護(hù)理、法醫(yī)、中醫(yī)等專業(yè)根據(jù)教學(xué)大綱選用,也可供從事臨床檢驗(yàn)工作和醫(yī)學(xué)研究的技術(shù)人員參考使用。
王大軍、車昌燕、韓梅、蘇春霞、原素梅、擺茹
醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?br />實(shí)驗(yàn)室規(guī)則第一章 抗原抗體反應(yīng)第一節(jié) 凝集反應(yīng)Ⅰ.直接凝集反應(yīng)一、玻片凝集試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 痢疾桿菌的血清學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)二 ABO血型鑒定二、試管凝集試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)三 血清抗體效價(jià)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)四 肥達(dá)試驗(yàn)Ⅱ.間接凝集反應(yīng)一、間接凝集試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)五 間接乳膠凝集試驗(yàn)——抗鏈球菌溶素O的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)六 間接乳膠凝集試驗(yàn)——類風(fēng)濕因子的檢測(cè)二、間接凝集抑制試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)七 乳膠間接凝集抑制試驗(yàn)——妊娠診斷試驗(yàn)三、反向間接血凝試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)八 甲胎蛋白檢測(cè)Ⅲ.協(xié)同凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)九 肺炎鏈球菌的快速診斷第二節(jié) 沉淀反應(yīng)Ⅰ.免疫擴(kuò)散試驗(yàn)一、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)二、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十一 人血清中IgG、IgA、IgM的測(cè)定Ⅱ.免疫比濁實(shí)驗(yàn)十二 人血清中補(bǔ)體C3的測(cè)定Ⅲ.免疫電泳實(shí)驗(yàn)十三 對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)十四 火箭免疫電泳第三節(jié) 補(bǔ)體參與的反應(yīng)實(shí)驗(yàn)十五 免疫溶血反應(yīng)實(shí)驗(yàn)十六 溶血空斑試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十七 50%溶血法(CH50)測(cè)總補(bǔ)體活性第四節(jié) 免疫標(biāo)記技術(shù)一、酶免疫技術(shù)實(shí)驗(yàn)十八 ELISA間接法檢測(cè)血清中結(jié)核特異性IgG抗體實(shí)驗(yàn)十九 ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)HBsAg實(shí)驗(yàn)二十 ELISA雙抗原夾心法檢測(cè)HBsAb二、免疫熒光技術(shù)實(shí)驗(yàn)二十一 間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體(ANA)三、放射免疫測(cè)定四、免疫印跡實(shí)驗(yàn)二十二 WesternBlot檢測(cè)組織中β-actin五、膠體金免疫技術(shù)實(shí)驗(yàn)二十三 斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)第二章 免疫細(xì)胞的檢測(cè)第一節(jié) 免疫細(xì)胞的分離與純化實(shí)驗(yàn)二十四 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離第二節(jié) T細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)二十五 T細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)——E花環(huán)形成試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二十六 T細(xì)胞亞群檢測(cè)——間接免疫熒光法實(shí)驗(yàn)二十七 T細(xì)胞功能檢測(cè)——淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)第三節(jié) NK細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)二十八 NK細(xì)胞活性檢測(cè)第四節(jié) 中性粒細(xì)胞功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)二十九 中性粒細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定第五節(jié) 巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)三十 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬實(shí)驗(yàn)第三章 細(xì)胞因子及其他免疫分子的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)三十一 IL-2活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)三十二 ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)TNF-α實(shí)驗(yàn)三十三 放射免疫分析法檢測(cè)IL-1β實(shí)驗(yàn)三十四 ELISA法檢測(cè)IFN-γ第四章 抗體的制備第一節(jié) 多克隆抗體的制備實(shí)驗(yàn)三十五 傷寒桿菌抗血清的制備第二節(jié) 單克隆抗體的制備實(shí)驗(yàn)三十六 單克隆抗體的制備第五章 綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)三十七 小鼠抗綿羊紅細(xì)胞多克隆免疫血清的制備及效價(jià)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)三十八 中草藥對(duì)小鼠免疫功能的影響實(shí)驗(yàn)三十九 環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫功能的抑制作用實(shí)驗(yàn)四十 慢性乙型肝炎患者機(jī)體免疫功能的檢測(cè)參考文獻(xiàn)附錄1 常用溶液的配制附錄2 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告冊(cè)
醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?br /><br>(一)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課目的<br>(1)加深對(duì)理論知識(shí)的理解和運(yùn)用。<br>(2)學(xué)習(xí)和掌握醫(yī)學(xué)免疫學(xué)的基本操作技術(shù)。<br>(3)培養(yǎng)學(xué)生從事科學(xué)實(shí)驗(yàn)的能力,即觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果、整理分析實(shí)驗(yàn)資料、綜合書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告和論文的能力。<br><br>(4)培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)作風(fēng),獨(dú)立分析和解決問(wèn)題的能力,相互幫助和團(tuán)結(jié)協(xié)作的精神。<br><br><br>(二)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課要求<br>(1)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)則。<br>(2)實(shí)驗(yàn)前做好預(yù)習(xí),明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒃怼⒅饕椒ā?shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng),做到心中有數(shù),提高實(shí)驗(yàn)的成功率。<br><br>(3)在實(shí)驗(yàn)時(shí),對(duì)要求動(dòng)手操作的實(shí)驗(yàn)應(yīng)按指導(dǎo)所列的步驟依次進(jìn)行,仔細(xì)觀察并認(rèn)真記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果或繪圖;多人同做一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)時(shí),要注意分工協(xié)作、密切配合;對(duì)示教的實(shí)驗(yàn)要仔細(xì)觀察,并應(yīng)聯(lián)系有關(guān)理論積極思考;實(shí)驗(yàn)中注意科學(xué)合理地分配和運(yùn)用時(shí)間。<br><br>(4)實(shí)驗(yàn)完畢,應(yīng)認(rèn)真分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,探討實(shí)驗(yàn)原理,得出可信的結(jié)論。若實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論不符合時(shí),要加以分析討論,以逐步提高自己的科學(xué)思維能力。實(shí)驗(yàn)課后,須按時(shí)按要求遞交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。<br><br><br>(5)防止發(fā)生各種事故。<br><br>醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)對(duì)象大多是病原微生物或含病原微生物的血、尿、糞便、痰液及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等,有傳染的危險(xiǎn)。要求同學(xué)們進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須嚴(yán)格遵守以下規(guī)則:<br>(1)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須先穿實(shí)驗(yàn)服,只帶必要的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、書籍和文具進(jìn)入,實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、書籍和文具應(yīng)放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)下的抽屜里,其他個(gè)人物品一律不得帶入實(shí)驗(yàn)室。<br><br>(2)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止飲食、吸煙、用嘴濕潤(rùn)鉛筆或標(biāo)簽等行為。<br><br>(3)在操作含病原微生物的實(shí)驗(yàn)時(shí),要堅(jiān)持無(wú)菌操作,既要防止標(biāo)本被污染,更要防止標(biāo)本中的病原微生物感染人體或污染環(huán)境。<br><br>(4)用過(guò)的吸管、滴管、試管、玻片等器材,應(yīng)放在指定的地方或含消毒液的容器內(nèi),不得放在桌面上或水池內(nèi),亦不得將帶病原微生物的液體傾入水槽。<br><br>(5)酒精燈不可互相點(diǎn)燃,以防發(fā)生意外。<br><br>(6)若發(fā)生割破手指、菌液進(jìn)入口、眼,或遇帶菌材料破損,污染環(huán)境、物品等事故時(shí),應(yīng)立即報(bào)告老師,及時(shí)進(jìn)行預(yù)防處理。<br><br>(7)不可擅自搬動(dòng)示教、實(shí)驗(yàn)器材或室內(nèi)設(shè)施。愛(ài)護(hù)公物,節(jié)約使用實(shí)驗(yàn)材料。如有損壞,應(yīng)立即向指導(dǎo)教師報(bào)告,并主動(dòng)在破損物品登記本上登記,某些物品需按規(guī)定酌情<br><br>(9)值日生負(fù)責(zé)整理清潔實(shí)驗(yàn)室(包括桌面、地面、實(shí)驗(yàn)設(shè)備等),然后關(guān)好水、電、門、窗,脫衣洗手后離室。<br><br><br>賠償(。8)實(shí)驗(yàn)完畢,應(yīng)清理桌面,把用過(guò)的物品放回原處(如顯微鏡、染色液、擦鏡紙、香柏油、火柴等)。<br>(10)未經(jīng)許可,不得將實(shí)驗(yàn)室內(nèi)任何物品帶出室外。<br><br>抗原抗體反應(yīng)(antigenantibodyreaction)指抗原與相應(yīng)的抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性反應(yīng)。抗原與抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原表位與抗體的高變區(qū)(hypervariableregion,HVR)之間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性,二者相互結(jié)合,在一定條件下出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。<br>在抗原抗體反應(yīng)中,可用已知抗體檢測(cè)未知抗原,也可用已知抗原檢測(cè)未知抗體,并可根據(jù)需要選擇定性或定量的測(cè)定方法。由于抗體主要存在于血清中,在檢測(cè)樣品時(shí)一般采用血清進(jìn)行試驗(yàn),故體外的抗原抗體反應(yīng)又稱為血清學(xué)試驗(yàn)。<br>(一)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)<br>1.<br>特異性 一種抗原一般只能與由它刺激機(jī)體所產(chǎn)生的抗體結(jié)合,這種抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性即特異性。抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。<br>可逆性 抗原與抗體的結(jié)合為非共價(jià)的可逆結(jié)合,結(jié)合后形成的復(fù)合物在一定條件下可以解離,解離后的抗原和抗體仍保持原有的性質(zhì)。<br>2.<br>比例性與可見(jiàn)性 體外抗原抗體反應(yīng)中,確定抗原抗體的最適比例十分重要。天然抗原分子表面一般有多個(gè)抗原表位,是多價(jià)。而單體的抗體分子(如IgG)是兩價(jià)。在抗原如果不考慮抗原抗體的數(shù)量比例,則很可能出現(xiàn)抗原或抗體過(guò)剩,<br>3.<br>抗體反應(yīng)中,<br>結(jié)果只有小<br>分子的復(fù)合物形成,F(xiàn)ab分別結(jié)合兩個(gè)抗原分子,相互交叉連接成網(wǎng)格狀復(fù)合體,此時(shí)有明顯的反應(yīng)物(沉淀物或凝集物)形成,肉眼可見(jiàn)(圖1-1)。<br>不能被肉眼觀察到。當(dāng)抗原抗體的數(shù)量比例恰當(dāng)時(shí),抗體分子的兩個(gè)<br><br>圖1-1 抗原抗體反應(yīng)的比例性和可見(jiàn)性<br>(二)抗原抗體反應(yīng)的影響因素<br>1.<br>電解質(zhì) 抗原與抗體結(jié)合后由親水性變?yōu)槭杷裕缬羞m當(dāng)濃度電解質(zhì)存在,可促進(jìn)其電荷丟失,形成大分子復(fù)合物。因此免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用生理鹽水或含鹽緩沖液作為稀<br><br>釋液或反應(yīng)液。<br>溫度 在一定溫度范圍內(nèi)(15~40℃),升高溫度可促進(jìn)抗原抗體分子的碰撞,加速可見(jiàn)反應(yīng)的出現(xiàn)。一般最適溫度為37℃。<br>2.3.<br>酸堿度 適宜的pH是抗原抗體反應(yīng)的重要條件,過(guò)酸或過(guò)堿都影響抗原抗體分子的性質(zhì)。最適酸堿度為pH6~8。<br>(三)抗原抗體反應(yīng)的類型<br>根據(jù)抗原的性質(zhì)、出現(xiàn)結(jié)果的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分不同,可將抗原抗體反應(yīng)分為凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參加的反應(yīng)、采用標(biāo)記物的抗原抗體反應(yīng)等。<br>第一節(jié) 凝集反應(yīng)<br>凝集反應(yīng)(agglutinationreaction)是顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合,在一定條件下,出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集物現(xiàn)象,稱為凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)包括直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)。<br>Ⅰ.直接凝集反應(yīng)<br>顆粒性抗原(細(xì)菌或紅細(xì)胞等)與特異性抗體直接結(jié)合,當(dāng)比例合適時(shí),出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象,稱為直接凝集反應(yīng)(directagglutinati-onreactions)(圖1-2)。<br><br>圖1-2 直接凝集反應(yīng)<br>實(shí)驗(yàn)方法可分玻片法和試管法兩種。玻片凝集試驗(yàn)一般用作定性檢測(cè),常用于病原菌的鑒定及分型、人類ABO血型的鑒定等;試管凝集試驗(yàn)常用于定量測(cè)定,如診斷傷寒、副傷寒的肥達(dá)試驗(yàn)等。<br>一、玻片凝集試驗(yàn)<br>實(shí)驗(yàn)一 痢疾桿菌的血清學(xué)鑒定【實(shí)驗(yàn)原理】<br>已知的抗細(xì)菌抗體(志賀菌屬多價(jià)診斷血清)與待檢細(xì)菌反應(yīng),如兩者為相對(duì)應(yīng)的抗原抗體,則直接結(jié)合出現(xiàn)凝集。可定性檢測(cè)細(xì)菌種類。<br>【實(shí)驗(yàn)材料】<br>待檢細(xì)菌(痢疾桿菌)18~24h培養(yǎng)物、志賀菌屬多價(jià)診斷血清、生理鹽水、載玻片、接種環(huán)、酒精燈等。<br><br>【實(shí)驗(yàn)方法】<br>(1)取一張潔凈的載玻片,用記號(hào)筆劃分為二格。<br><br>(2)以無(wú)菌取材法于左側(cè)加2接種環(huán)診斷血清,右側(cè)加2接種環(huán)生理鹽水。<br><br>(3)左、右側(cè)分別加入挑取的待檢細(xì)菌。<br><br>(4)輕搖玻片1~2min,觀察結(jié)果。<br><br><br>【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】<br>首先觀察鹽水對(duì)照側(cè),呈均勻混濁狀;再觀察試驗(yàn)側(cè),出現(xiàn)乳白色凝集塊者即為陽(yáng)性;對(duì)照側(cè)及試驗(yàn)側(cè)均呈均勻混濁,不出現(xiàn)凝集為陰性;如對(duì)照側(cè)及試驗(yàn)側(cè)均出現(xiàn)凝集,為自凝。<br>實(shí)驗(yàn)二 ABO血型鑒定【實(shí)驗(yàn)原理】<br>血型是根據(jù)紅細(xì)胞表面血型抗原的種類而判定的。人類ABO血型系統(tǒng)即將紅細(xì)胞上有A抗原者稱A型,有B抗原者稱B型,同時(shí)存在A、B抗原者稱AB型,無(wú)A、B抗原者稱O型。據(jù)此,分別用已知標(biāo)準(zhǔn)含抗A抗體和含抗B抗體的試劑與受試者紅細(xì)胞作凝集反應(yīng),便可判定受試者的血型。<br>【實(shí)驗(yàn)材料】<br>玻片、已知標(biāo)準(zhǔn)抗A血型定型試劑和抗B血型定型試劑、刺血針、酒精棉球、無(wú)菌干棉球。<br>【實(shí)驗(yàn)方法】<br>(1)取潔凈玻片一張用記號(hào)筆劃分兩個(gè)區(qū),標(biāo)明A、B。<br><br>(2)在A、B兩側(cè)分別滴1滴已知標(biāo)準(zhǔn)抗A血型定型試劑和抗B血型定型試劑。<br><br>(3)酒精棉球消毒被檢查者的耳垂,用刺血針刺血。<br><br>(4)取少量血液分別與已知標(biāo)準(zhǔn)抗A血型定型試劑、抗B血型定型試劑混勻。<br><br>(5)搖轉(zhuǎn)玻片數(shù)次,靜置數(shù)分鐘,觀察結(jié)果。<br><br><br>【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】<br>實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1-1。<br>表1-1 ABO血型鑒定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果<br>抗A血型定型試劑抗B血型定型試劑血型判定<br>--O型+-A型-+B型++AB型<br>注:“+”表示凝集現(xiàn)象;“-”表示未出現(xiàn)凝集。<br>【注意事項(xiàng)】<br>(1)一般在室溫20~24℃內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn),37℃條件,可使反應(yīng)減弱。<br><br>(2)所用器材必須干燥清潔,為避免交叉污染,建議使用一次性器材。血型定型試劑從<br><br>冰箱取出后,應(yīng)待其平衡至室溫后再用,用畢后應(yīng)盡快放回冰箱保存。<br>(3)反應(yīng)時(shí)間不能少于10min,否則較弱凝集不能出現(xiàn),造成假陰性。<br>(4)對(duì)含有較多冷凝集素的受檢者,在鑒定血型時(shí)往往被誤定為AB型,遇到此種情況,需先用37℃生理鹽水洗滌受檢紅細(xì)胞2~3次,以去除吸附在紅細(xì)胞上的冷凝集素,然后再進(jìn)行鑒定。<br><br>(5)血型定型試劑如出現(xiàn)渾濁或變色,則不能使用;若開(kāi)瓶使用時(shí)間較長(zhǎng),最好用已知A、B、O血型紅細(xì)胞進(jìn)行檢查,判斷結(jié)果是否與已知血型相符,以防因制品污染、變質(zhì)失效等原因造成鑒定錯(cuò)誤。<br><br><br>二、試管凝集試驗(yàn)<br>實(shí)驗(yàn)三 血清抗體效價(jià)的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)原理】<br>試管凝集反應(yīng)是一種定量試驗(yàn),用定量的顆粒性抗原懸液與一系列稀釋度的待檢血清混合,根據(jù)每管內(nèi)顆粒抗原凝集程度,以判定待檢血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其效價(jià)。如用已知傷寒沙門菌H(或O)菌液檢測(cè)患者血清中有無(wú)相應(yīng)抗傷寒桿菌H(或O)抗體及其效價(jià)。<br>【實(shí)驗(yàn)材料】<br>1∶10稀釋的待測(cè)患者血清、傷寒沙門菌H(或O)菌液、生理鹽水、小試管、吸管、水浴箱。<br>【實(shí)驗(yàn)方法】<br>(1)取7支小試管,排成一排,依次編號(hào),每管加入0.5ml生理鹽水。<br><br>(2)吸取0.5ml待測(cè)患者血清(1∶10)加入1號(hào)管中,反復(fù)吹吸三次,充分混勻,吸出<br><br><br>0.5ml加入2號(hào)管中,同法混勻,吸出0.5ml加入3號(hào)管,依次類推至6號(hào)管,吸出0.5ml棄之,7號(hào)管為對(duì)照。<br>(3)從7號(hào)管開(kāi)始依次向前每管加入傷寒沙門菌H菌液0.5ml,此時(shí)試管中血清的稀釋度又遞增了一倍。<br><br>(4)菌液加畢,振搖試管,充分混勻,置37℃或室溫24h,觀察結(jié)果(表1-2)。拿出時(shí),切勿振蕩。<br><br>