本書由江南大學、重慶大學和南京工業大學從事酶工程教學的一線教師集體編寫而成，以經典案例分析的方式論述了酶工程技術基礎知識，將基礎理論與酶工程的工業應用及科學研究相結合。全書共分八章——酶工程基礎、酶的發酵生產、酶的提取與分離純化、酶功能改造、酶與細胞的固定化、非水相酶催化、酶反應器及酶的應用。
本書可作為高等院校生物工程、生物技術、輕工業等相關專業本科生和研究生的教材和參考書，也可供廣大教學、相關科研單位和企業的科技人員與工程技術人員學習和參考。
《酶工程(案例版生物工程系列規劃教材)》編著者吳敬。本書作為提高學生實際操作能力的教材，目標是培養學生掌握生物技術及其產業化的科學原理、工藝技術過程和工程設計等基礎理論、基本技能和一定的工程化開發能力，培養能在生物技術與工程領域從事設計、生產、管理和新技術研究、新產品開發的工程技術人才。因此，本書在編寫過程中簡要論述相關基本原理，盡量避免與其他基礎課程重復，將更多的篇幅用于案例分析，力求采用工程學的方法，將工程技術歸納為基本操作單元，以經典案例分析的方式重點論述各單元操作。在案例的組織上，每章有典型案例，章節內部穿插小案例；在案例的編寫上，按照“問題的提出一解決的思路一達到的目標”的程序進行，并且盡可能多地采用圖表、流程圖等形式；在案例的選擇上，本著生物工程的一般特點，不過分突出某些高校在此專業上的特色，從而使本書有更好的適用性。
前言
第一章 酶工程基礎
第一節 酶工程概述
第二節 酶催化作用機制
第三節 酶促反應動力學和抑制作用
第四節 酶活力的影響因素
第五節 酶的多樣性
第六節 總結與展望
思考題
主要參考文獻
第二章 酶的發酵生產
第一節 微生物產酶菌種
第二節 產酶培養基及種子培養
第三節 酶發酵的工藝控制
第四節 酶合成的調節
前言
第一章 酶工程基礎
第一節 酶工程概述
第二節 酶催化作用機制
第三節 酶促反應動力學和抑制作用
第四節 酶活力的影響因素
第五節 酶的多樣性
第六節 總結與展望
思考題
主要參考文獻
第二章 酶的發酵生產
第一節 微生物產酶菌種
第二節 產酶培養基及種子培養
第三節 酶發酵的工藝控制
第四節 酶合成的調節
第五節 提高發酵產酶的措施
思考題
主要參考文獻
第三章 酶的提取與分離純化
第一節 粗酶液的制備
第二節 酶的分離純化
第三節 酶制劑工藝
思考題
主要參考文獻
第四章 酶功能改造
第一節 酶基因工程改造的基本原理
第二節 酶的定點突變
第三節 酶分子的定向進化
第四節 酶的半理性設計
第五節 酶的化學修飾
思考題
主要參考文獻
第五章 酶與細胞的固定化
第一節 酶的固定化
第二節 輔酶的固定化
第三節 細胞固定化
第四節 酶和細胞固定化載體
第五節 固定化酶(細胞)的表征
第六節 固定化酶(細胞)的應用
思考題
主要參考文獻
第六章 非水相酶催化
第一節 典型的非水相酶催化體系
第二節 有機溶劑體系中的酶結構與性質
第三節 非水相酶催化的影響因素及調控策略
第四節 非水相體系酶催化的典型例子
思考題
主要參考文獻
第七章 酶反應器
第一節 酶反應器類型及操作方式
第二節 酶反應器設計
第三節 分批酶反應器
第四節 固定化酶反應器
第五節 酶膜反應器
思考題
主要參考文獻
第八章 酶的應用
第一節 酶在食品工業中的應用
第二節 酶在紡織、制革和造紙工業中的應用
第三節 酶在飼料工業中的應用
第四節 酶在生物質燃料加工中的應用
第五節 酶在洗滌劑工業中的應用
思考題
主要參考文獻
第一章 酶工程基礎
<br>第一節 酶工程概述
<br>一、酶與酶工程
<br>酶是由細胞產生的具有催化能力的蛋白質。對于生物體來說，新陳代謝是生命活動最重要的特征，而酶是調節一切代謝反應的物質，酶缺陷或者酶失活，有可能使代謝停止，生命也會因此而結束。因此，研究酶的理化性質及其作用機理，對于闡明生命現象的本質，掌握生命活動的規律，進而改造生命具有十分重要的意義。此外，現代生命科學的發展已經深入到分子水平，在酶分子水平上探討酶與生命活動、代謝調節、疾病、生長發育等現象的關系將有助于加深人們對生命的理解，探究生命的起源與衍變。
<br>人們真正認識到酶的存在始于19世紀。1833年，法國化學家Payen和Person將麥芽的水抽提液用乙醇沉淀得到了一種對熱不穩定的活性物質，它可促進淀粉水解成可溶性糖，他們把這種物質稱為淀粉酶（diastase）制劑。雖然現在已經獲知當時得到的只是粗酶，含有很多雜蛋白質，但是由于采用了最簡單的抽提、沉淀等提純方法，他們得到了一種無細胞制劑，并指出了它的催化特性和不穩定性，開始觸及酶的一些本質問題，因此有人認為Payen和Person首先發現了酶。1878年，德國科學家Kuhne首先把這類活性物質稱為“Enzyme”，Enzyme來自希臘文，原意為“在酵母中”，中文譯為酶。1896年，德國科學家Buehner兄弟發現了用石英砂磨碎的酵母細胞及無細胞濾液能像酵母細胞一樣將1分子葡萄糖轉化成2分子乙醇和2分子二氧化碳，他們把這種能催化反應的蛋白質成分稱為酒化酶（zymase）。他們的實驗結果表明，酶能以溶解且有活性的狀態從破碎細胞中分離出來，并能在體外催化反應。此項發現促進了對酶的分離及其理化性質的研究，也促進了對生命過程中有關酶系統的研究。
<br>20世紀初，酶學研究得到了迅速發展。一方面，人們發現了更多的酶，并注意到某些酶的作用需要有小分子物質（輔酶）參與；另一方面，在物理、化學技術發展的輔助下，Michaelis和Menten總結前人的工作經驗，于1913年根據中間產物學說提出了酶促反應動力學原理――米氏學說。這一學說的提出，對酶反應機制的研究是一個重要突破。1926年，美國化學家Sumner從刀豆中得到脲酶結晶（這是第一個酶結晶），并證明這種結晶可以催化尿素水解產生二氧化碳和氨，并通過化學實驗得出酶本身就是一種蛋白質的結論，但直到Northrop和Kunitz獲得了胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、胰蛋白酶結晶，并用相應方法證明其化學本質都是蛋白質（1930～1936），這個觀點才被普遍接受。20世紀五六十年代，通過一系列觀察發現酶具有一定水平的柔性，因而Koshland于1958年提出了誘導契合學說，以解釋酶的催化機制和專一性，同時也發現某些酶的催化活性的改變與生理條件的變化有關。1961年，Monod等提出了變構模型，定量解釋了有些酶的活性可以通過結合小分子（效應物）進行調節，從而為認識細胞中許多酶反應的調控機制提供了基礎。1969年，首次報道由氨基酸單體化學合成牛胰核糖核酸酶，雖然其純度和活性較低，但是定性證明了酶與非生物催化劑之間具有相似的催化特性。
<br>除了“經典”的蛋白酶以外，又相繼發現一些其他的生物分子也具有催化活性。1982年，美國的Cech小組發現，四膜蟲的rRNA（核糖體核糖核酸）前體能在完全沒有蛋白質的情況下進行自我加工，催化得到成熟的rRNA 產物。也就是說，這個RNA分子本身就具有催化活性。這對酶的化學本質是蛋白質的傳統概念是個嚴重挑戰，引出了酶并不一定是蛋白質的問題。后來，人們陸續發現更多的具有生物催化活性的RNA分子，統稱為核酶（ribozyme）。1986年，Schultz和Learner兩個小組同時報道了用事先設計好的過渡態類似物作半抗原，按標準單克隆抗體制備法獲得了具有催化活性的抗體，即抗體酶（abzyme）。這一重要突破為酶的結構功能的探索和抗體與酶的聯合應用提出了新的研究思路。
<br>回顧酶的研究歷程可知，對酶的研究一直是沿著理論與應用兩個方向開展的。理論方面包括酶理化性質及催化性質的研究，其任務是要從分子水平更深入地揭示酶的結構和功能的關系、酶的催化機制與調節機制、酶和生命活動的關系，在基因水平上進行對酶的理性設計與改造。應用研究促進了酶工程概念的形成，其主要目標是通過將基因工程、分子生物學等技術成果應用于酶的生產改造以提高酶的產量及其催化活性，同時不斷開發新型的固定化酶技術與酶反應器以提高酶的使用效率，最終形成高效、經濟的酶工程產業。1808年，羅門等利用胰酶制皮革；1917年，法國人用枯草桿菌產生的淀粉酶作為紡織工業上的退漿劑；1949年，日本采用深層培養法生產αG淀粉酶獲得成功，使酶制劑的生產應用實現工業化；1959年，葡萄糖淀粉酶催化淀粉生產葡萄糖新工藝的研發成功，徹底廢除了原來葡萄糖生產中需要高溫高壓的酸水解工藝，并使淀粉葡萄糖轉化率從80%提高至100%，這項新工藝的成功大大促進了酶在工業中的應用；1966年，日本千鈿一郎成功地進行了氨基酰化酶的固定化，并于1969年將其應用于工業上連續化拆分DLG氨基酸。20世紀70年代大規模開展了固定化細胞、輔酶共固定、增殖細胞固定、動植物細胞固定等研究，同時根據酶反應動力學理論，運用化學工程成果建立了多種類型的酶反應器，在這些基礎上酶工程的發展日臻成熟。
<br>二、酶工程簡介
<br>生物工程又稱生物技術或生物工藝學，是20世紀70年代發展起來的一門綜合性技術學科。它整合生物學、化學和工程學的技術，改造物種，分離改造生物體中的某些組分（如酶、蛋白質、核酸、細胞器），進而利用生物分子的某些特殊機能（如酶的催化功能、抗體的免疫功能）為工農業生產及醫療衛生服務。通常，生物工程主要分為發酵工程（微生物工程）、酶工程、基因工程和細胞工程4個分科，它們相互依存、相互促進。其中，酶工程是生物工程的重要組成部分，與其他三大工程尤其是發酵工程關系密切。
<br>酶工程是隨著酶學研究迅速發展，特別是酶的應用推廣使酶學和工程學相互滲透結合而形成的一門新的技術科學，是酶學、微生物學的基本原理與化學工程有機結合而產生的邊緣科學技術。它是在一定生物反應裝置中利用酶的催化性質，將原料轉化或加工成相應產品的技術，是生物工程的重要組成部分，主要包括以下9個方面。
<br>（一）酶的生產
<br>酶制劑的來源有微生物、動物和植物，其中以微生物為主，一般選用優良的產酶菌株，通過培養發酵來生產酶。為了提高酶的產量，可以通過選育優良菌株、構建基因工程菌、優化發酵條件來實現。工業生產需要特殊性能的新型酶，如耐高溫αG淀粉酶、耐堿性蛋白酶和脂肪酶等，因此，需要篩選或者構建能生產特殊性能新型酶的菌株。
<br>（二）酶的分離純化
<br>酶的分離純化技術是當前生物技術“后處理工藝”的核心。采用各種分離純化技術，可從微生物細胞及其發酵液或動、植物組織提取液及其細胞培養液中得到高活性的不同純度的酶制劑。為了使酶制劑更廣泛地應用于各個領域，必須提高酶制劑的活性、純度和收率，需要研究開發新的分離純化技術。
<br>（三）酶和細胞固定化
<br>采用各種固定化方法可對酶進行固定化，制備固定化酶。對固定化酶的酶學性質及應用條件加以研究可以提高酶的穩定性、重復使用酶制劑、擴大酶制劑的應用范圍，全面提高酶的工業價值。固定化細胞是在固定化酶的基礎上發展起來的一項技術，二者既有聯系又有區別。用各種固定化方法對微生物細胞、動物細胞和植物細胞進行固定化，制成固定化細胞。
<br>研究固定化細胞的酶學性質，擴展固定化細胞的應用范圍，是當今酶工程的一個熱門課題。
<br>（四）酶修飾及分子改造
<br>為了克服酶自身性質上的一些不足，可采用各種修飾方法對酶的結構進行改造，以改善天然酶的性質，如高穩定性、無抗原性、蛋白酶水解抗性等，甚至創造出新的催化活性，擴大酶的應用范圍，從而提高酶的應用價值。
<br>酶修飾及分子改造可以從以下兩個方面進行。
<br>（1）用蛋白質工程技術，如定向進化、定點突變等對酶分子的結構進行改造，以期獲得一級結構和空間結構較為合理的具有優良特性的突變酶或新酶。例如，在洗衣粉中添加枯草芽孢桿菌蛋白酶可加強其去污能力，但這種酶在漂白劑的作用下易失去活性，利用蛋白質工程技術替換酶蛋白分子的某些氨基酸，可大大提高酶的抗氧化能力，從而使其可與漂白劑同時使用。
<br>（2）用化學修飾法對酶分子中側鏈基團進行化學修飾，以改變酶的理化性質，最后達到改變酶催化性質的目的。這類酶修飾在酶學基礎研究和醫藥研發上特別有用。
<br>（五）非水相催化
<br>在非水相中，酶分子受到非水相介質的影響，其催化特性與在水相中有著較大的不同。
<br>目前，研究最多的非水相介質是有機溶劑。在有機介質中，酶能夠基本保持其整體結構和活性中心的空間構象，因此能夠最大限度地發揮其催化功能。酶的非水相催化還包括氣相介質中的酶催化、超臨界介質中的酶催化、離子液介質中的酶催化等。
<br>（六）酶傳感器
<br>酶傳感器又稱酶電極。酶傳感器是一種生物傳感器，它是由感受器（如固定化酶）和換能器（如離子選擇性電極）所組成的一種分析裝置，可用于測定混合溶液中某種物質的濃度。
<br>（七）酶反應器
<br>酶反應器是根據酶的催化特性而設計的反應設備。其設計目標是提高生產效率、降低成本、減少耗能與污染，以獲得最佳的經濟效益和社會效益。酶反應器的種類有攪拌罐型反應器、固定床反應器、流化床反應器、膜反應器、鼓泡式反應器等。
<br>（八）抗體酶、人工酶和模擬酶
<br>抗體酶是一類具有催化活性的抗體，是抗體的高度專一性與酶的高效催化能力巧妙結合的產物。人工酶是指人工合成的具有催化活性的多肽或蛋白質。據1977年Dhar等報道，人工合成的GluGPheGAlaGGluGGluGAlaGSerGPhe八肽具有溶菌酶的活性，其活性為天然溶菌酶的50%。近年來，合成了一些具有催化功能，但相比酶結構簡單得多的非蛋白質分子，這些分子可以模擬酶對底物的結合和催化過程，既具備酶的高效催化性，又能夠克服酶的不穩定性，這種物質稱為模擬酶。
<br>（九）酶技術的應用
<br>研究與開發酶制劑在食品、醫藥、發酵、紡織、制革、化學分析、氨基酸合成、有機酸合成、半合成抗生素合成、能源開發及環境工程等方面的應用。
<br>第二節 酶催化作用機制
<br>一、酶的催化特性
<br>（一）酶具有非常高的催化效率
<br>酶的催化效率是指在最適條件下，1分子酶在單位時間內所能催化的底物分子數，以分子活性來表示。分子活性高表示它能催化的反應進行得快，大多數酶的分子活性約為每分鐘1000，個別可達百萬以上。在溫和條件下，酶通常比無機催化劑的催化效率高得多。但酶不能改變化學反應的平衡點，酶的作用是縮短了到達平衡所需的時間，但平衡常數不變。
<br>（二）酶的高度專一性
<br>酶的專一性（也稱特異性）是指一種酶只能催化特定的底物進行特定的反應。催化的高度專一性是酶最重要的特性，是其與化學催化劑的最主要區別之一，也是酶反應工程優越于一般的化學反應工程的原因所在。酶的專一性是生命活動必需的，在復雜的酶體系中，若沒有催化反應的專一性，則生物體內的新陳代謝就會發生紊亂，最終導致生物體的凋亡。例如，氨酰GtRNA合成酶的高度專一性保證了生物系統為了維持其遺傳穩定性所需蛋白質合成的高度精確性。不同的酶專一性往往不同，一般來說，酶的專一性有3個方面。
<br>1.底物專一性
<br>酶只能催化某一種特定底物或只能與某一類特定底物發生反應，按嚴格程度的不同分為絕對專一性和相對專一性。
<br>絕對專一性是指一種酶只能催化一種物質進行一種反應。例如，脲酶只能催化尿素分解，而對尿素的氯或甲基取代物H2NCONHCl和H2NCONHCH3則不起作用。琥珀酸脫氫酶僅催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸（反丁烯二酸），而對其同系物（丙二酸、戊二酸）不僅不起作用，反被抑制。
<br>相對專一性是指一種酶能催化一類結構相似的物質進行某種相同類型的反應。其中有些酶只作用于一定的鍵而對鍵兩側的基團無嚴格要求，稱為鍵專一性，如酯酶催化酯鍵水解，對RC
<br>O
<br>.
<br>O―R' 中的R與R'基團無嚴格要求，既能催化甘油酯類、簡單酯類，也能催化
<br>丙酰、丁酰膽堿或乙酰膽堿的水解，只是不同的酯類水解速度不同。而有些酶除了要求一定的化學鍵外，對鍵兩側的基團也有不同程度的要求，這種特異性稱為基團專一性。以各類蛋白酶為例，胰蛋白酶水解的鍵必須是堿性氨基酸的羧基形成的肽鍵、酯鍵或酰胺鍵；胰凝乳蛋白酶則要求被水解的鍵有芳香氨基酸或其他疏水氨基酸的羧基參與；彈性蛋白酶能專一水解丙氨酸、甘氨酸及絲氨酸等短脂肪鏈氨基酸的羧基形成的肽鍵；胃蛋白酶只作用于芳香氨基酸的氨基和酸性氨基酸及蛋氨酸羧基形成的肽鍵。
<br>2.反應專一性
<br>指某一種酶只催化某一類反應。例如，同樣以葡萄糖為底物，不同酶催化不同的反應，得到不同的產物，如下所示：
<br>葡萄糖
<br>葡萄糖異構酶→果糖
<br>葡萄糖+O2
<br>葡萄糖氧化酶→葡萄糖酸
<br>葡萄糖+ATP 己糖激酶→葡萄糖G6G磷酸
<br>葡萄糖+NADPH 醛糖還原酶→山梨糖
<br>3.立體專一性
<br>立體專一性主要是考慮底物空間構象的專一性。酶的立體專一性相當普遍，可以說幾乎所有酶均具有立體專一性。立體專一性又可分為光學異構專一性和幾何異構專一性。
<br>光學異構專一性又稱DL立體異構專一性。旋光物質有D型和L型之分。凡是只能催化兩個對映體中的一個，而不能催化另一個的特異性，稱為DL立體異構專一性。例如，精氨酸酶只水解LG精氨酸，不能水解DG精氨酸。
<br>幾何異構專一性又稱順反立體特異性。含雙鍵物質有順反兩種異構體，如順丁烯二酸（馬來酸）和反丁烯二酸（延胡索酸），延胡索酸水合酶只能催化反丁烯二酸水合生成蘋果酸，或催化其逆反應，而對順丁烯二酸及其水合物均無作用。
<br>（三）酶活性的可調節性
<br>酶作為生物催化劑，與化學催化劑相比，還有一個特點是其活性的可調節性。主要有下列7種方式。
<br>1.酶濃度的調節
<br>酶濃度的調節主要有兩種方式：一種是誘導或阻遏酶的合成；一種是調節酶的降解。例如，當環境中沒有乳糖時，βG半乳糖苷酶的合成處于被阻遏狀態，當乳糖存在時，去除了阻遏作用，酶受乳糖的誘導而合成。
<br>2.激素調節
<br>激素調節與生物合成有關。例如，乳糖合成酶有兩個亞基，催化亞基和修飾亞基。催化亞基本身不能合成乳糖，但可以催化半乳糖以共價鍵的方式連接到蛋白質上形成糖蛋白。修飾亞基和催化亞基結合后，改變了催化亞基的專一性，可以催化半乳糖和葡萄糖反應生成乳糖。修飾亞基的水平是由激素控制的。妊娠階段，在乳腺生成和分娩的過程中激素水平急劇變化，導致修飾亞基大量合成，并和催化亞基結合，催化生成乳糖補充乳汁。
<br>3.共價修飾調節
<br>在一種酶分子上，共價地引入一個基團從而改變它的活性，引入的基團又可以被其他酶催化除去，從而恢復原先的活性。例如，磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化，大腸桿菌谷氨酰胺合成酶的腺苷酸化和去腺苷酸化都屬于共價修飾調節。
<br>4.限制性蛋白酶水解作用調節
<br>限制性蛋白酶水解是一種高特異性的共價修飾調節系統。細胞內合成的新生肽大都以無活性的前體形式存在，只有生理需要時，才通過限制性水解作用使前體轉變為具有生物活性的蛋白質或酶，從而啟動和激活各種生理功能，如酶原激活、血液凝固、補體激活等。除了參與酶活性調控外，限制性蛋白酶水解作用還起著切除、修飾、加工多肽鏈的作用，因而具有重要的生物學意義。
<br>5.抑制劑的調節
<br>酶的活性會受到大分子抑制劑或小分子抑制劑的抑制，從而影響其活力。前者如胰臟的胰蛋白酶抑制劑（抑肽酶），后者如磷酸變位酶的抑制劑（2，3G二磷酸甘油酸）。
<br>6.反饋調節
<br>許多小分子物質的合成是由一連串酶促反應組成的。催化第一步反應的酶，往往可以被其終端產物所抑制，這種對自我合成的抑制稱為反饋抑制，這在生物合成中是較為常見的現象。例如，異亮氨酸可抑制其合成代謝通路中的第一個酶――蘇氨酸脫氨酶的催化活性，當異亮氨酸的濃度降低到一定水平時，抑制作用解除，合成反應又重新開始。
<br>7.金屬離子和其他小分子化合物的調節
<br>很多金屬離子對酶的活性均有一定的激活或者抑制效應。有一些酶需要K+ 活化，NH4+往往可以代替K+ ，但Na+不能活化這些酶，有時還有抑制作用，這一類酶有LG高絲氨酸脫氫酶、丙酮酸激酶、天冬氨酸激酶和酵母丙酮酸羧化酶。另一些酶需要Na+活化，K+ 起抑制作用，如腸中的蔗糖酶可被Na+ 激活。二價金屬離子（如Ca2+ 、Zn2+ 、Mg2+ 、Mn2+等）往往也是一些酶具有活性的必需離子。小分子化合物同樣也會影響到某些酶的催化活性。
<br>（四）酶促反應條件溫和
<br>酶促反應一般要求在常溫、常壓、接近中性酸堿度等溫和的條件下進行。酶是生物大分子，對環境的變化非常敏感，高溫、強酸、強堿、重金屬等都可引起蛋白質的變性，使酶喪
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